Ученые из Вашингтонского университета и коллабораторы предложили новый подход к доставке полноразмерного гена дистрофина с помощью вирусных векторов. Для этого они использовали белковый сплайсинг — процесс, при котором из белка вырезаются внутренние части (интеины). В частности, ученые применили расщепленные интеины, которые располагаются на концах двух разных полипептидных цепей. В ходе белкового транс-сплайсинга такие расщепленные интеины объединяются и вырезаются, при этом полипептидные цепи тоже соединяются вместе, образуя единый белок.

Для начала ученые провели скрининг расщепленных интеинов на примере зеленого флуоресцентного белка. Последовательность кодирующего его гена разбивали на две части, к которым добавляли расщепленные интеины; такие конструкции экспрессировали в клетках HEK293, а эффективность сборки целого белка после его транс-сплайсинга оценивали по интенсивности флуоресценции. Из-за крупного размера гена дистрофина его пришлось разбить на три части, поэтому ученым нужно было две пары расщепленных интеинов с высокой специфичностью ко своей второй половине. По итогам скрининга ученые отобрали интеины Aha, pg41.1, IMPDH и Nrdj1. Однако также они обратили внимание на то, что после вырезания интеинов из белка в нем остается небольшой «шрам» из шести аминокислотных остатков, присутствие которого может сказаться на функциях белка. При этом те же аминокислоты нужны интеинам для узнавания своей половины. Ученые попробовали уменьшить эти фрагменты полипептидной цепи и проверили, сохраняют ли в этом случае интеины свою активность и специфичность. В результате им удалось сократить этот «шрам» всего до двух аминокислотных остатков в случае IMPDH и Nrdj1 и до трех — в случае gp41.1 с сохранением специфичности.

Далее ученые внесли расщепленные интеины в состав фрагментов дистрофина. Для начала они попробовали создать конструкт с мидидистрофином, содержащий примерно две трети последовательности полного гена. В отличие от микродистрофина, мидидистрофин содержит почти все функционально важные домены: C-конец белка, цистеин-богатый домен, домен локализации NO-синтазы и актин-связывающий домен на N-конце белка. Исследователи пожертвовали только десятью спектриновыми повторами.

Чтобы проверить эффективность работы интеинов, ученые трансфицировали клетки HEK293 либо контрольной плазмидой, несущей полный ген мидидистрофина, либо двумя плазмидами, которые содержат два фрагмента мидидистрофина с расщепленными интеинами. При использовании интеинов экспрессия мидидистрофина была в 5–8 раз выше по сравнению с доставкой всего одной плазмиды. Используя три вектора и две пары расщепленных интеинов, ученые также смогли доставить в клетки полноразмерный дистрофин. При этом для соединения N-концевой части белка с центральным фрагментом использовали интеины IMPDH или Nrdj1, а для соединения центрального фрагмента с C-концевой частью — интеин gp41.1. В этом случае при использовании интеинов экспрессия белка была в 2–4 раза выше, чем при доставке целого гена в одной плазмиде.

Исследователи продолжили работать с полученными конструкциями in vivo. Их доставляли в переднюю большеберцовую мышцу мышей с миодистрофией Дюшенна (mdx-4cv) под мышцеспецифическим промотором/энхансером CK8e, а в качестве вектора использовали AAV6 (5*10¹⁰ вирусных геномов). Через 5 недель ученые анализировали мышцы животных. У мышей, которым вводили два вектора с фрагментами мидидистрофина, экспрессировался этот белок, однако также в значительном количестве (50–70% всех продуктов) присутствовал C-концевой фрагмент, не прошедший сплайсинг. При этом экспрессия была в 4 раза выше при использовании интеина Nrdj1. Иммуноокрашивание также показало, что мидидистрофин локализовался в сарколемме так же, как и у мышей дикого типа. Аналогичным образом в мышцы мышей вводили три вектора с двумя парами интеинов, причем экспрессия полноразмерного дистрофина была повышена при использовании пары gp41.1 и Nrdj1. В этом случае помимо полного белка также детектировались его отдельные части, не прошедшие сплайсинг, однако он действительно проходил специфично: ученые не зарегистрировали неправильно сшитых фрагментов дистрофина. Экспрессия полноразмерного дистрофина также улучшила морфологию мышц.

Двойные или тройные векторы также подошли для системной доставки гена. Ученые вводили 2*10¹⁴ вирусных геномов на кг (эта дозировка соответствует максимальной дозе вируса, используемой в клинических испытаниях генной терапии для заболеваний мышц) двойных или тройных векторов мышам с миодистрофией Дюшенна, а в качестве контроля доставляли микродистрофин в одном векторе. Через три месяца в передней большеберцовой мышце мышей экспрессия мидидистрофина составляла 75% от уровня дистрофина у здоровых животных, а для полноразмерного дистрофина и микродистрофина это значение составило 31% и 8%. При этом в мышечных волокнах все формы дистрофина экспрессировались неравномерно, а наибольшей экспрессии удалось добиться в сердечной мышце, причем белок экспрессировался в каждом кардиомиоците. Эту особенность ученые связали с тропизмом AAV6, который более эффективно проникает в клетки сердечных мышц, а не скелетных.

Из-за этого исследователи заменили вектор, в дальнейшем используя AAVMYO, для которого характерен тропизм к скелетным мышцам. Чтобы оценить, насколько такая генная терапия убирает симптоматику миодистрофии, мышам вводили единственный или двойной вектор, содержащие микро- или мидидистрофин, в низкой (2*10¹³ вирусных геномов на кг) или высокой (2*10¹⁴ вирусных геномов на кг) дозировке. В качестве контроля использовали вектор AAV9 с микродистрофином. Суспензию вирусов вводили в хвостовую вену молодых мышей с миодистрофией Дюшенна, а через три месяца анализировали их переднюю большеберцовую мышцу. При использовании в качестве вектора AAVMYO экспрессия микро- и мидидистрофина была как минимум в два раза выше, чем при использовании AAV9. Низкая доза AAVMYO с микродистрофином улучшила мышечную силу, но не защитила животных от повреждения, связанного с сокращением мышц. Зато все показатели улучшились при применении двойных векторов AAVMYO с мидидистрофином при низкой дозировке. У этой группы животных также был снижен уровень креатинкиназы — маркера повреждения мышц. И в случае микро- и мидидистрофина удалось нормализовать морфологию мышц, причем более эффективным оказался мидидистрофин.

У животных моделей миодистрофии Дюшенна течение болезни усугубляется с возрастом: возникает дисфункция диафрагмы, кардиомиопатия, фиброз и нарушение работы скелетных мышц. Чтобы выяснить, можно ли с помощью доставки миодистрофина убрать эти симптомы, ученые на протяжении семи месяцев вводили старым мышам с миодистрофией AAV9 или AAVMYO в низкой дозировке (2*10¹³ вирусных геномов на кг) с микро- или мидидистрофином. При использовании в качестве вектора AAV9 микродистрофин доставлялся всего в 5% мышечных волокон, тогда как для AAVMYO эффективность доставки достигала 60%. В случае с AAV9, который доставлял микродистрофин, ученым не удалось избавиться от фиброза мышц, зато некоторые улучшения наблюдались при доставке того же микродистрофина с помощью AAVMYO. Наибольшей эффективностью обладал мидидистрофин, который доставляли в двойных векторах AAVMYO: помимо нормализованной морфологии мышечных волокон повышалась мышечная сила, они становились более устойчивыми к травмам. Помимо скелетных мышц мидидистрофин улучшал функцию сердечных мышц, а также диафрагмы.

Исследователи планируют совершенствовать свой подход на основе белкового транс-сплайсинга. Расщепленные интеины, которые они использовали в работе, бактериального происхождения, поэтому могут вызвать иммунную реакцию. Кроме того, пока неясно, какой может быть эффект от их присутствия в клетках. Иммунный ответ также могут вызвать фрагменты полипептидных цепочек мидидистрофина или полноразмерного дистрофина, как и сам факт экспрессии дистрофина в клетках, где его до этого никогда не было. Следовательно, ученым еще предстоит снизить потенциальную иммуногенность доставляемых конструктов.

Ген fhl2b защитил рыбок данио от мышечных дистрофий